Wichtige biomedizinische Mikroskopietechnik kann nun tiefer in das Gewebe eindringen.

Eine kürzlich entwickelte Technik, die als Lichtschnitt-Fluoreszenzmikroskopie bekannt ist, hat zu vielen biologischen Entdeckungen geführt, indem sie es Forschern ermöglicht hat, 3D-Bilder von Gewebe, sogar von lebenden tierischen Embryonen, mit Hilfe von fluoreszierenden Tags zu erstellen. Jetzt berichten Forscher über die Fähigkeit, die Abbildungstiefe der Lichtschnitt-Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines optischen Phänomens zu erhöhen, das als Drei-Photonen-Absorption bekannt ist.

In der Zeitschrift Optics Letters der Optical Society (OSA) berichten die Forscher ausführlich, wie die Drei-Photonen-Absorption mit der Fluoreszenzmikroskopie von Lichtschnitten genutzt werden kann, um tiefer in das Gewebe einzudringen. Als Demonstration verwendeten sie die kombinierte Technik, um klare Bilder in einer Kugel von kultivierten Zellen, bekannt als Sphäroid, mit einem Durchmesser von etwa 450 Mikron zu erzeugen.

„Diese Demonstration ist sehr wichtig, da sie ein unerfülltes Bedürfnis nach besserer Bildgebung in der Tiefe adressiert, das den Wissenschaftlern helfen könnte, bessere Daten über biologische Prozesse zu gewinnen“, sagte der Leiter des Forschungsteams, Kishan Dholakia von der University of St. Andrews in Großbritannien. „Dieser Ansatz könnte besonders nützlich für neurowissenschaftliche und entwicklungsbiologische Studien sein und könnte Anwendung finden, wenn es darum geht, mehrere Proben automatisch für die Medikamentenentwicklung abzubilden“.

Das für die Abbildung von Fluoreszenzmarkierungen benötigte Licht kann schädlich und sogar tödlich für empfindliche biologische Proben wie Hirngewebe oder tierische Embryonen sein, die zur Untersuchung von Entwicklungs- und Krankheitsprozessen verwendet werden. Die Light-Sheet-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine schnelle, hochauflösende Bildgebung mit geringer optischer Beschädigung, da sie eine Probe mit nur einer dünnen Schicht Licht beleuchtet; andere Teile der Probe erhalten keine unnötige Belichtung.

„Wir erwarten, dass die Drei-Photonen-Lichtband-Fluoreszenzmikroskopie einen großen Einfluss auf die Bildgebung des Gehirns bei Nagetieren wie Mäusen und Ratten haben wird, wo sie dazu verwendet werden könnte, sehr weiträumige Bilder mit subzellulärer Auflösung aufzunehmen“, sagte der Erstautor des Papiers, Adrià Escobet-Montalbán.

Tiefergehende Bildgebung

Die Forscher wollten die Drei-Photonen-Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie mit der bisher verwendeten Zwei-Photonen-Absorption vergleichen. Bei der Multiphotonenabsorption gibt das fluoreszierende Etikett Licht ab, nachdem es zwei oder drei Photonen absorbiert oder von ihnen angeregt wurde, und nicht das eine Photon, das zur Erzeugung der traditionellen Fluoreszenz verwendet wird.

Die Multiphotonenabsorption reduziert unscharfes Licht und minimiert Licht, das die Probe schädigen könnte, da sie längere Wellenlängen verwendet, die weniger vom Gewebe gestreut werden, und indem sie das Anregungslicht auf ein kleines Volumen beschränkt. Wenn drei Photonen verwendet werden, um Fluoreszenz zu erzeugen, anstatt zwei, werden diese Vorteile verstärkt.

Um ihre neue Technik zu demonstrieren, verwendeten die Forscher einen optischen Standardaufbau für die Lichtschnitt-Fluoreszenzmikroskopie mit einem gepulsten Laser, der traditionell für die Zwei-Photonen-Anregung verwendet wird. Obwohl dieser Laser nicht die beste Wahl für die Erzeugung einer effizienten Drei-Photonen-Anregung war, war er ideal für den Vergleich von Zwei-Photonen- und Drei-Photonen-Anregung.

Das Forschungsteam hat die Sphäroide von menschlichen embryonalen Nierenzellen mit Hilfe von Zwei- und Drei-Photonen-Anregung abgebildet. In der Nähe der Oberfläche des Sphäroids verliefen beide Bildgebungsverfahren ähnlich. Auf der anderen Seite des Sphäroids blieb jedoch der Bildkontrast bei der Fluoreszenzmikroskopie mit drei Photonen erhalten, während die Qualität des Zwei-Photonen-Bildes deutlich abnahm.

Optimierung der Technik

Um die Tiefenabbildung und das Sichtfeld weiter zu verbessern, experimentierten die Forscher damit, das Lichtintensitätsprofil des Lasers in einen Bessel-Strahl umzuwandeln, der einen zentralen hellen Kern aufweist, der von konzentrischen Ringen umgeben ist, und nicht den traditionellen festen Gaußschen Laserstrahl wie der eines Laserpointers.

„Bessel-Strahlen können im Zwei-Photonen-Lichtbandmodus verwendet werden, können aber aufgrund ihrer konzentrischen Ringe potenzielle Artefakte liefern“, sagte Federico Gasparoli, Co-Autor. „Zum ersten Mal zeigen wir numerisch und experimentell, dass diese Probleme in der Drei-Photonen-Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie unterdrückt werden und dass der Strahl noch tiefer geht, was diesen Ansatz sehr attraktiv macht.“

Als nächstes wollen die Forscher die Technik verbessern, indem sie Lasersysteme mit längeren Wellenlängen einsetzen, die speziell für die Drei-Photonen-Absorption ausgelegt sind. Dies sollte eine Bildgebung in größerer Tiefe ermöglichen. Parallel dazu arbeiten die Forscher an der Entwicklung von Methoden, um das von Fluoreszenzmarkierungen emittierte Licht tief in den Proben zu erfassen.

Mehr Informationen:
Adrià Escobet-Montalbán et al, Drei-Photonen-Lichtband-Fluoreszenzmikroskopie, Optics Letters (2018). DOI: 10.1364/OL.43.005484

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