Den Knoten binden: Neue DNA-Nanostrukturen

Knoten sind unverzichtbare Werkzeuge für menschliche Aktivitäten wie Segeln, Fischen und Klettern (ganz zu schweigen von dem Binden von Schuhen). Aber einen Knoten in einem spitzenartigen DNA-Strang zu binden, der nur milliardstel Meter lang ist, erfordert Geduld und hochspezialisiertes Fachwissen.

Hao Yan, Forscher bei der ASU, ist eine praktizierte Hand in diesem heiklen und exotischen Bereich, die an der Schnittstelle von Nanotechnologie und bildender Kunst arbeitet.

In neuen Forschungen, die in der Zeitschrift Nature Communications erscheinen, beschreiben Yan und seine Kollegen Fei Zhang, Xiaodong Qi und andere ein Verfahren zum Überreden von Segmenten einzelsträngiger DNA zu komplexen 2- und 3-D-Knotenstrukturen.

Die Ergebnisse stellen einen wichtigen Fortschritt auf dem schnelllebigen Gebiet der DNA-Nanotechnologie dar, bei der das Molekül des Lebens als struktureller Baustoff für eine Vielzahl von winzigen Konfigurationen verwendet wird. Dazu gehören winzige Roboterbauelemente, photonische Anwendungen, Drug-Delivery-Systeme, Logik-Gates sowie diagnostische und therapeutische Anwendungen.

„Die in dieser Arbeit geknoteten DNA-Strukturen weisen eine beispiellose topologische Komplexität auf, die weit über das hinausgeht, was vor der Verwendung der einzelsträngigen Faltung erreicht wurde“, sagt Yan. „Tatsächlich ist es nicht nur erstaunlich, sondern auch überraschend, dass sich die einzelsträngige DNA und RNA durch ihre eigenen Ketten fädeln und einen Weg finden kann, so hoch verknotete Strukturen zu bilden, da der Einzelstrang durch so viele Verflechtungen weben muss.“

Yan leitet das Biodesign Center for Molecular Design and Biomimetics und ist Martin D. Glick Distinguished Professor an der School of Molecular Sciences an der ASU.

DNA in die Falte bringen

Die neue Studie beinhaltet Innovationen auf dem Gebiet des DNA-Origami, das, wie der Name schon sagt, Nukleinsäuren wie DNA und RNA verwendet, um sich zu falten und zu komplexen Formen zusammenzusetzen. Dies geschieht, wenn komplementäre Nukleotidbasen im 4-Letter-Alphabet der DNA nach einem strengen Schema in Kontakt kommen und binden: C-Basen immer Paar mit G und A-Basen immer Paar mit T.

In der Natur liefern Nukleinsäurestränge den Code, der zur Herstellung komplexer Proteine benötigt wird. Diese grundlegende Biologie bildet die Grundlage für alles irdische Leben. Durch die Nutzung der einfachen Basenpaarungseigenschaften der DNA ist es möglich, Strukturen zu entwerfen, die sich im Labor selbst aufbauen. Die Methode wurde sowohl auf einzelsträngige als auch auf doppelsträngige DNA-Formen angewendet, was zu Nanostrukturen von zunehmender Komplexität und Komplexität führt.

Während DNA-Origami seit seiner Gründung erstaunliche Fortschritte gemacht hat, war eine technische Innovation äußerst schwierig zu erreichen. Bislang ist es den Forschern entgangen, komplexe verknotete Strukturen in der DNA auf vorhersehbare und programmierbare Weise zu erzeugen.

Die neue Arbeit überwindet diese Hürde und legt präzise Designregeln fest, die es ermöglichen, einzelsträngige DNA-(oder RNA)-Segmente im Bereich von 1800-7500 Nukleotiden zu knotenartigen Nanostrukturen mit Kreuzungszahlen (wobei der DNA-Strang in und aus seiner eigenen Länge einwebt) im Bereich von 9 bis 57 zu bilden.

Die Gruppe zeigte ferner, dass diese Nukleinsäure-Nanostrukturen sowohl unter Laborbedingungen als auch in lebenden Systemen repliziert und amplifiziert werden können.

Die Knoten der Natur

Knotenstrukturen, wie sie Yan hergestellt hat (aber viel einfacher als die synthetischen), haben Korrelate in der Natur. Sie wurden in DNA und Proteinen beobachtet und bilden sich im Allgemeinen während der Replikation und Transkription (wenn eine DNA-Sequenz in eine Messenger-RNA kopiert wird). Sie können auch in den Genomen von Phagen-Viren vorkommen, die Bakterienzellen infizieren.

Dennoch erfordert die Konstruktion von Molekülknoten im Nanometerbereich, die klar definierte und konsistente Geometrien aufweisen, eine enorme Kontrolle und Präzision. Zufälligerweise sind Nukleinsäuren wie die DNA ideal für das Design und die Synthese solcher molekularen Knoten.

Bisher wurden für nanoskalige Konstruktionen Längen doppelsträngiger DNA verwendet, mit dem Zusatz von kurzen Stücken oder „Klammersträngen“, um die entstehenden Strukturen miteinander zu verbinden. Die neue Studie verwendet stattdessen eine einzelne Länge der DNA, die so konzipiert ist, dass sie sich in einer präzisen, vorprogrammierten Abfolge von Schritten um sich selbst wickelt.

Sobald sich die geknoteten DNA-Nanostrukturen erfolgreich aufgebaut haben, werden sie mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet. Eine sorgfältige Berechnung ermöglicht es den Forschern, die Faltbahnen zu optimieren, um für jede synthetische Struktur den höchsten Ertrag zu erzielen. Die Verwendung von ein- statt doppelsträngiger DNA ermöglicht es, die Strukturen in Hülle und Fülle zu wesentlich geringeren Kosten herzustellen.

Ein einzelsträngiger Ansatz öffnet die Tür für das Design von Nanoarchitekturen mit spezifischen, klar definierten Funktionen, die durch aufeinander folgende Runden der In-vitro-Evolution erzeugt werden können, bei denen die gewünschten Attribute in einem wiederholten Verfeinerungsprozess ausgewählt werden. Darüber hinaus bietet der in der neuen Studie skizzierte Ansatz eine allgemeine Plattform für das Design von Molekülstrukturen mit erhöhter Größe und beispielloser Komplexität und ebnet den Weg für Fortschritte in der Nanophotonik, der Wirkstofffreisetzung, der Kryo-EM-Analyse und der DNA-basierten Speicherlösung.

Designer-DNA (und RNA)

Für einen der ersten Knotenentwürfe wurde die Strategie von Yan und seinen Kollegen entwickelt, bei der ein einzelner DNA- oder RNA-Strang 9 mal nach einer vorprogrammierten Sequenz durch sich selbst geführt wurde, was zeigt, dass das neue Verfahren in der Lage ist, komplexe geometrische Formen zu erzeugen, die programmierbar, replizierbar und skalierbar sind.

Die Designstrategie wurde anschließend auf einzelsträngige RNA-Strukturen und 3D-DNA-Knoten ausgeweitet, deren Formen mit einer Technik der so genannten kryogenen Transmissionselektronenmikroskopie rekonstruiert wurden, die ihre korrekte Faltung in die gewünschten Formen bestätigt.

„Eine der Herausforderungen bei dieser Arbeit ist, wie man die Montageausbeute von stark verästelten Strukturen erhöht.“ Sagte Fei. Im Gegensatz zu klassischen DNA-Nanostrukturen sind die einzelsträngigen Knoten aufgrund der topologischen Komplexität weniger fehlerverzeihend in Bezug auf die präzise Faltreihenfolge. Wenn eine einzelne Kreuzung während des Prozesses falsch gefaltet wird, wird der Fehler kaum selbst korrigiert und die meisten der Fehlfaltungen bleiben in der fertigen Struktur. „Wir haben eine hierarchische Falzstrategie entwickelt, um die korrekte Bildung von Knoten zu steuern. Wir verglichen die Falteffizienz eines Knotens mit 23 Kreuzungen, indem wir verschiedene Faltwege verwendeten. Die AFM-Bilder zeigten eine dramatische Steigerung der Falzausbeute von gut geformten Strukturen von 0,9% auf 57,9% durch Anwendung eines optimierten hierarchischen Faltverfahrens.“ Fei fügte hinzu.

Die Designregeln zur Optimierung der Faltungswege basieren auf der Anzahl der Kreuzungspunkte, der Länge der DNA und der Anzahl der Basenpaare in der entworfenen Struktur. Es wurden drei Grundregeln aufgestellt. Erstens wurden lineare Faltbahnen den verzweigten Bahnen vorgezogen. Zweitens sollte der entfaltete Abschnitt eines DNA-Strangs im Frühstadium, wenn der Strang noch lang ist, nicht durch sich selbst geführt werden. Schließlich sollten Kanten der gewünschten Form, die drei Kreuzungen aufweisen, vor solchen mit zwei Kreuzungen gefaltet werden.

Gemäß der Designstrategie war das Team in der Lage, komplexere DNA-Knoten mit zunehmenden Kreuzungszahlen zu erstellen.

Längere Ketten einzelsträngiger DNA stellen besondere Herausforderungen für die Gestaltung programmierter Nanostrukturen dar, da die Wahrscheinlichkeit einer unbeabsichtigten Selbstkomplementarität der Basen der Kette steigt. Eine DNA-Knotenstruktur mit 57 gekreuzten Knoten, die erfolgreich zusammengesetzt wurden, allerdings mit geringerer Ausbeute und weniger Präzision. Als die Kreuzungszahl auf 67 erhöht wurde, sank die Ausbeute deutlich und die daraus resultierenden Strukturen, aufgenommen von AFM, zeigten mehr Montagefehler.

Die Studie berichtet über die größten bisher montierten DNA-Knoten, die aus bis zu 7,5k Basen gebildet wurden, mit den kompliziertesten Topologien und bis zu 57 Kreuzungsbereichen. Die einzelsträngigen DNA-Sequenzen können in lebenden Zellen massenhaft für mehr Effizienz bei geringeren Kosten hergestellt werden. Letztendlich können DNA-Nanostrukturen unterschiedlicher Funktion in den Zellen gebildet werden, Innovationen, die in der zukünftigen Arbeit verfolgt werden sollen.

Mehr Informationen:
Xiaodong Qi et al, Programmierung molekularer Topologien aus einzelsträngigen Nukleinsäuren, Nature Communications (2018). DOI: 10.1038/s41467-018-07039-7

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