Bereit für den Elektronentransportweg eines Bakteriums im Nahbereich.

In einer kürzlich von Hongri Gong und Kollegen durchgeführten Studie wurde ein respiratorischer Superkomplex aus dem Bakterium Mycobacterium smegmatis isoliert und seine Struktur mit einer Auflösung von 3,5 Å mittels Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM) visualisiert. Das Bakterium ist ein enger Verwandter der M. tuberculosis und ein beliebtes Modell zur Untersuchung vieler anderer Bakterienarten. Die detaillierte Struktur zeigte, wie Elektronen in der Zelle in einem bisher unbekannten Prozess übertragen wurden.

Typischerweise wird chemische Energie zur Synthese von Adenosintriphosphat (ATP) und energetischen Zellreaktionen während der Zellatmung durch Kopplung der Oxidation einer Energiequelle (Zucker, Fettsäuren und Aminosäuren) und der Reduktion eines Elektronenakzeptors (Sauerstoff, Schwefel, Nitrat und Sulfat) gewonnen. Bei der aeroben Zellatmung wird Energie von den Elektronendonatoren über die Elektronentransportkette (ETC) an den Endakzeptor Sauerstoff extrahiert, um einen transmembranen Protonengradienten zu erzeugen, der als Protonenantriebskraft (PMF) bekannt ist und die ATP-Synthese antreibt. Die neuen, jetzt in Science veröffentlichten Ergebnisse zeigen einen direkten Zusammenhang für den Elektronentransfer zwischen Enzymen, um einen neuen Modus der Katalyse der Atmungskette darzustellen.

Chinone und Cytochrome sind zwei Arten von Elektronenträgern in ETCs, mit denen Elektronen zu und von großen, in die Membran eingebetteten makromolekularen Strukturen geleitet werden. Vier Membranoxidoreduktasen sind an der mitochondrialen Atmungskette für den Elektronentransfer beteiligt. Dazu gehören der Komplex I (NADH:ubiquinon oxidoreductase, CI), der Komplex II (Succinat:ubiquinon oxidoreductase, CII), der Komplex III (bc1-Typ ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase, bc1-Typ CIII) und der Komplex IV (aa3-Typ cytochrome c oxidase, aa3-Typ CIV). Durch Funktion kann CIII Ubichinol zu Ubichinon oxidieren und die Elektronen an das lösliche Cytochrom c weitergeben. Die Elektronen werden dann zu CIV geleitet, wo Sauerstoff zu Wasser reduziert wird. Die Transmembran PMF wird durch Protonenpumpen in CI, CIII und CIV erzeugt.

In der prokaryontischen Atmungskette ist die Situation komplizierter. Ein vollständiger Weg des Elektronenflusses ist im Zelltyp aufgrund seiner Komplexität noch nicht festgelegt. Es ist daher notwendig, die komplette Struktur eines „Superkomplexes“ zu verstehen, der beim bakteriellen Elektronentransfer beteiligt ist, um das Ziel zu unterstützen. In der Studie extrahierten und reinigten die Forscher den Komplex aus M. smegmatis, um die Architektur mit Hilfe der Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM) mit einer Auflösung von 3,5 Å zu visualisieren. Die Struktur lieferte entscheidende Erkenntnisse über den Mechanismus des direkten Elektronentransfers innerhalb eines respiratorischen Superkomplexes. Die Abmessungen des Superkomplexes lagen im Bereich von 200 x 70 x 120 Å, in einer symmetrischen linearen Architektur, die sich von den bisher berichteten respiratorischen Superkomplexen völlig unterscheidet. Durch die Zusammensetzung wurde das lineare dimere CIV1-CIII2-CIV1 so angeordnet, dass einzelne CIVs das zentrale CIII-Dimer auf beiden Seiten flankierten. Die Informationen zeigten einen direkten Zusammenhang zwischen den Enzymen während des Elektronentransfers, der einen neuen Modus der Katalyse der Atmungskette darstellt. Die detaillierten strukturellen Ergebnisse haben das Potenzial, bei der Entdeckung von antimykobakteriellen Medikamenten zu helfen.

Bei Experimenten mit bakteriellen Zellkulturen verwendeten die Autoren einen M. tuberculosis-ähnlichen Wasserstoffperoxid-resistenten M. smegmatis-Mutantenstamm. Die Zellen wurden wie zuvor beschrieben kultiviert und die Membran isoliert. Nach Zellkultur, Ernte und Zelllyse wurden Zellmembranpellets geerntet, um Atemwegs-Superkomplexe zu extrahieren. Die Superkomplexe wurden mittels optischer Spektroskopie, Massenspektroskopie und 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) Färbung charakterisiert. Um Hämegruppen zu identifizieren, wurden ausgewählte Fraktionen analysiert, indem Spektren vor und nach der Reduktion mit Dithionat wie zuvor beschrieben aufgezeichnet wurden. Die gereinigten Proben wurden mit Hilfe der nativen Massenspektroskopie zur Untersuchung der Architektur und die einzelnen Strukturkomponenten mit zuvor etablierten Protokollen analysiert.

Während der Kryo-EM-Analyse verwendeten die Forscher Uranylacetat (1 Prozent Gew./Vol.) für die Negativfärbung, wobei 5 µl der Superkomplexprobe in einer Konzentration von 0,05 mg/ml verwendet wurden, wurden Bilder mit einem FEI Tecnai Spirit Mikroskop aufgenommen, das bei 120 kV für den ersten Modellbau arbeitet. Die aufgenommenen Bilder wurden mit einer niedrigauflösenden Rekonstruktion des Superkomplexes aus 53 Mikroaufnahmen der negativ gefärbten Probe verarbeitet. Für die vollständige Rekonstruktion des Superkomplexes wählten die Autoren bei der Kryo-EM-Bildverarbeitung 7.600 Mikroaufnahmen aus 8.200 Original-Mikroaufnahmen manuell aus. Alle Figuren in der Studie wurden mit PyMOL oder UCSF-Chimäre erstellt.

Die Autoren zeigten die Kryo-EM-Struktur eines CIII-CIV-Atemsuperkomplexes der M. smegmatis-Bakterien. Der intrakomplexe Elektronenübertragungsweg reichte von der Chinoloxidation in CIII bis zur Sauerstoffreduktion in CIV. Die Ergebnisse zeigten einen neuen Mechanismus für den gabelförmigen Elektronentransfer, um den Q-Zyklus (die Nettobewegung von Protonen über eine Lipiddoppelschicht) für die Energieübertragung zu gewährleisten. Die Assoziation einer Superoxiddismutase in der Architektur des Systems kann vor oxidativen Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) schützen. Die Architektur der Chinonbindungsstellen bot auch einen Rahmen für zukünftige Studien zur strukturbasierten antimikrobiellen Wirkstofffindung.

Mehr Informationen:
Hongri Gong et al. Ein Elektronenübertragungsweg verbindet Untereinheiten eines mykobakteriellen respiratorischen Superkomplexes, Science (2018). DOI: 10.1126/science.aat8923

Eric F. Pettersen et al. UCSF Chimera?A Visualisierungssystem für explorative Forschung und Analyse, Journal of Computational Chemistry (2004). DOI: 10.1002/jcc.20084

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